赛多利斯慢病毒载体整体解决方案全新发布，助力GCT发展

中国GCT疗法蓬勃发展

自1990年全球第一个基因细胞疗法（Gene and Cell Therapy，简称为GCT）被批准进入临床试验至今，GCT的发展距今已有30多年的历史^[1]。作为全球第二大经济体的中国，早在2003年由SFDA(中国食品药品监督管理局，目前为NMPA)批准的以腺病毒载体（AdV）治疗头颈癌的药品——今又生（Gendicine）就已上市，这不仅是中国也是全球第一个被批准上市的GCT药物。

2017年，美国FDA批准上市的两款基于慢病毒载体（Lentiviral Vector，LV），进行体外（Ex-vivo）基因编辑的CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T Cell）产品上市，更是GCT疗法发展过程中的重要里程碑，对于中国乃至全球CAR-T产品的发展都有积极的推动作用。至2020年，全球体外（Ex-vivo）GCT疗法临床项目累计1035个，其中T细胞的体外基因编辑临床项目约80%（图1）^[2]。 

自2013年-2022年，我国已进入临床1，2，3期的CAR-T项目已有555个（数据来源于 ClinicalTrials.gov），已经批准上市的CAT-T产品已有两个（表1）。

图1.全球细胞治疗临床试验中基因编辑靶细胞比例

表1.我国已上市CAR-T产品

数据来源: CDE:信息公开 ＞ 上市药品信息

病毒载体制备面临挑战

GCT疗法蓬勃发展需要基因载体技术的完善与创新，目前递送目的基因的载体主要有两类，即病毒类载体与非病毒类载体。由于病毒载体是可高效递送目的基因途径，因此病毒载体是目前应用最为广泛。应用于临床项目中的病毒载体有：腺病毒（AdV），腺相关病毒（AAV），逆转录病毒（RV），慢病毒（LV），单纯疱疹病毒（HSV）与痘病毒（Vaccinia）。由于Gamma逆转录病毒与慢病毒（Lentivirus），这两类病毒作为基因递送的病毒载体，使目的基因在递送的靶细胞中长期稳定表达，因此GCT疗法中的应用比例较高，约占28%，其中慢病毒载体（LV）占比排名第一（基于2010-2020 全球GCT临床项目），约20%（图3）^[2]，主要用于CAR-T以及TCT-T疗法的目的基因修饰与递送。

图2.临床项目中病毒载体应用情况

目前病毒载体的制备，尤其是慢病毒的制备普遍存在一些挑战与需求：

• 产能较低，需要提高产量

• 工艺线性放大难，且工艺不稳定，需要稳定且平台化的上下游工艺

• 降低生产过程中污染风险

• 降低生产成本

点击咨询获得定制化慢病毒整体解决方案

赛多利斯慢病毒载体整体解决方案

LV病毒载体制备工艺的上游目的是基于瞬转或稳转细胞株在尽可能少的引入污染物前提下包装出大量的病毒载体数量，而下游工艺则是在尽可能最大保留目标病毒颗粒的同时去除产品与工艺相关的杂质。赛多利斯在GCT领域，可提供端到端，一站式从上游到下游，从早期工艺开发优化到商业化生产的整体平台化解决方案。本文旨在介绍赛多利斯在LV上下游工艺的整体解决方案。

针对于慢病毒载体上游工艺赛多利斯可提供(图3)：

• 从上游工艺开发、优化到大规模生产所需设备与耗材，实现LV可放大的稳定上游工艺方案

• 人性化，灵活的DOE软件平台，提高LV上游工艺的开发与优化效率

• 提供多种搅拌模式的封闭生物反应器系统，实现LV的上游工艺的灵活性

• 化学成分100%明确，无动物成分、无血清，满足HEK293瞬转/稳转表达系统包装LV的培养基与补料系统

图3. 赛多利斯上游工艺平台

通过在Ambr^®15模块中基于MODDE^®(DOE)进行LV的开发与滴度优化，进而获得提高LV滴度的上游工艺参数；在Ambr^®250模块中可进行上游工艺的放大以及优化后上游工艺的稳健性确认。（详细内容详见“慢病毒载体悬浮培养工艺开发新策略：平行式生物反应器与DOE强强联合”）

图4. 在Ambr系统上基于MODDE进行LV上游工艺开发与优化

Ambr^®系列细胞培养系统包含Ambr^®15，Ambr^®250系统，可满足：

• 细胞克隆筛选早期工艺开发与优化

• 病毒载体上游工艺开发与工艺优化

• 灌注工艺开发与优化

图5. Biostat^® RM系列

图6. Biostat^® STR 50-2000L

已有文献报道，大规模慢病毒载体制备时采用一次性搅拌生物反应器进行悬浮培养较贴壁培养，可有效降低成本^[3]。赛多利斯可提供满足不同混匀模式，不同规格需求的生物反应器： 

• 基于摇摆式混匀生物反应器Biostat^® RM ，低剪切力混匀，对剪切力敏感的LV友好

• 基于搅拌式混匀生物反应器Biostat STR^® 第3代系列以及自动化控制平台，赋予上游生产灵活性与智能性，确保上游工艺的稳定性与一致性

图7. HEK293 培养基

赛多利斯HEK293专为配合HEK293细胞系的高变异性与病毒载体工艺的复杂性而设计，适合高效悬浮培养的培养基与补料系统，加速病毒载体的工艺开发与生产：

• 化学成分100%明确，无动物源、无血清

• 液体与干粉形式可供选择

• 根据ISO9001和ISO13485质量标准生产

• 性能、可扩展性和质量都极高，从而确保最终产品的纯度、安全性

• 可用于瞬时转染/感染或悬浮体系

收获后的LV料液需要经过一系列的纯化去除工艺与产品相关的杂质。但下游纯化过程中，因LV的尺寸大小与结构特殊性（存在包膜），导致其容易被拦截；且对于pH，温度，剪切力等条件敏感，易造成其失活，从而导致LV的收率偏低。因此在下游纯化工艺中需要选择合适的方法，确保提高LV回收率。LV的下游工艺路线存在多种选择（图8）^[4]。但主要集中在利用直流过滤、切向流过滤、以及层析等手段进行LV的澄清、浓缩换液、纯化、微生物负荷/除菌控制。

图8. LV下游工艺路线

针对于慢病毒载体下游工艺赛多利斯可提供：

• 下游工艺开发与优化到大规模生产的设备与耗材，实现LV下游工艺可线性放大

• 基于膜过滤技术和离心分离技术的多种澄清方案，适用于不同浊度的LV收获液澄清

• 不同材质、流道、孔径、规格的超滤膜包与中空纤维可灵活搭配，易操作的超滤系统，实现不同阶段LV的快速浓缩与换液

• 层析工艺选择的多样性：提供膜层析与整体柱方案，提高层析操作效率

• 低吸附，高有效过滤面积的除菌过滤提高LV终端除菌过滤收率

LV病毒载体澄清工艺解决方案平台

在LV上游工艺中，不同的细胞培养模式以及细胞密度造成收获时不同的初始浊度，赛多利斯可提供基于膜过滤分离的澄清技术解决方案以及基于离心技术的澄清方案。

基于膜过滤分离技术澄清工艺方案

图9. Sartopure^® PP3过滤系列

LV收获液初始浊度较低时，可优先考虑膜过滤技术作为病毒澄清的手段，赛多利斯提供多种膜材的直流过滤产品，如聚丙烯材质（PP）的Sartopure^® PP3。

• Sartopure^® PP3由多层PP材质折叠而成，多层孔径有效拦截不同尺寸的杂质颗粒

• 稳定且广泛的化学兼容性，可耐受多种酸碱溶液以及有机试剂

• 低吸附性，低溶出析出

• 广泛的截留精度：0.45 to 100 µm，多种规格选择

基于离心技术澄清工艺方案

图10. Ksep^®一次性离心系列

应用Ksep^®一次性离心系统对于高初始浊度的LV收获液澄清，具有优势：

• 逆流离心技术（Counterflow Centrifugation）温柔作用于LV，病毒回收率高，有效去除细胞、细胞碎片
  

• 操作简单，稳定可扩展

• 封闭系统，降低污染风险

• 免清洁验证，提高澄清工艺效率

LV病毒载体超滤工艺解决方案平台

LV 下游纯化工艺中，有1~2步需要采用切向流过滤技术，对LV料液进行浓缩与换液，起到减小料液体积以及调整pH与电导，去除可滤性杂质的作用。针对LV超滤工艺，赛多利斯提供TFF产品Vivaflow^®，适用于小体积样品处理，以及基于平板膜包（Sartocon^®）与中空纤维（WaterSep^®）两种可放大的超滤产品，满足不同工艺阶段与工艺规模的需求。

图11. Vivaflow^®超滤系统

Vivaflow^® 可提供Hydrosart^®，PES，RC*三种材质：

• 免安装，可重复使用，加速样品制备

• 独特的flip-flow流道确保提供最佳通量

• 提供Vivaflow^®50、50R、200三种规格，可处理0.1-5L样品

RC*材质Vivaflow® 仅提供50规格，截留孔径为100kD

图12. 不同规格超滤膜包系列

Sartocon^®膜包提供Hydrosart^®稳定性纤维素材质与聚醚砜（PESU）聚合物材质，其特征分别为：

Hydrosart^®稳定性纤维素材质

• 低吸附、易清洗、产品寿命长

• 可反复使用，抗污堵能力强

• 提供2~300kD MWCO

聚醚砜（PESU）聚合物材质

• 在广泛的pH值和温度范围内稳定

• 提供1~300kD MWCO

图13.WaterSep^®中空纤维

此外，赛多利斯也提供改性聚醚砜膜（m-PES）制成的中空纤维产品：

• 低吸附，回收率高

• 多产线选择：一次性使用的Green产品，可高压灭菌Steamer产品，可清洗、重复使用的Reuse产品

• 提供3~750kD MWCO

图14. 超滤系统：，与

赛多利斯同样提供与超滤膜包，中空纤维搭配的超滤系统。

• Ambr^® crossflow+MODDE^® 技术平台可进行关键超滤参数优化（eg. 进口压力，TMP等），提高优化效率

• Sartoflow^® Smart，Advanced两款模块化台式切向流系统，可安装涵盖从50cm²至0.14m²面积，适用于实验室工艺开发和临床试验，以及0.1m²到2.1m²面积，适用于cGMP生产

图15. 纯化产品：，Sartobind^® Q 膜层析与

目前LV下游工艺中多应用阴离子层析技术对HCP，HCD，BSA以及其他杂质去除。赛多利斯可提供基于膜层析技术的Sartobind^® Q以及一体柱模式的CIMmultus^® DEAE^[5]两种高通量，高载量的层析纯化产品，用于快速捕获纯化LV。搭配一次性层析系统，可建造封闭系统，用于LV的大规模纯化。

• 运行流速快，通量高，可节省时间成本，提高纯化效率

• Sartobind^® Q和吸附器的结合载量比树脂填料高10倍；可提供最小0.019ml（96孔板），最大5L多种不同规格

• CIMmultus^® DEAE具备高分辨率能力与低剪切流动特性相结合，以获得高纯度的产品和提高产率；可提供1ml~40L不同规格

病毒载体除菌过滤与

终端灌装工艺解决方案平台

图16. Sartopore^®除菌过滤系列

Sartopore^®系列除菌过滤器，采用不对称双层亲水聚醚砜材质，适合生物技术以制药领域的广泛应用，其特点：

• 热稳定性与亲水性好

• 出色的可润湿性与极低的蛋白吸附性

• 新型Twin Pleat^®折叠技术，有效增大有效过滤面积

• 回收率好

针对LV工艺中涉及的培养基/液配置，液体转移，以及无菌连接，冻存，存储等需求，赛多利斯可提供流体管理的相应解决方案；此外针对LV滴度检测，以及无菌、微生物快速检测，赛多利斯提供，等产品。

以上为赛多利斯针对LV工艺能够提供的主要耗材与设备，详细产品信息可登录赛多利斯官方网站进行查阅。

可或

长按识别下方二维码联系产品专家

了解更多赛多利斯慢病毒整体解决方案

参考文献

上下滑动查看全部文献

[1] J.A. Wolff, J. Lederberg, An early history of gene transfer and therapy, Hum.Gene Ther. 5 (1994) 469–480.

[2] F. Arabi V. Mansouri N. Ahmadbeigi, Gene therapy clinical trials, where do we go? An overview,Biomedicine & Pharmacotherapy Volume 153, 2022.

[3] Ruxandra-Maria Comisel a, Bo Kara b, Frederick H. Fiesser c, Suzanne S. Farid, Lentiviral vector bioprocess economics for cell and gene therapy commercialization, Biochemical Engineering Journal 167 (2021) 107868.

[4] Ana Sofia Moreira, David Guia Cavaco, Tiago Q. Faria, Paula M. Alves, Manuel J. T. Carrondo, and Cristina Peixoto; Advances in Lentivirus Purification, Biotechnol. J. 2021, 16, 2000019.

[5] Vanessa Bandeira, Cristina Peixoto, Ana F. Rodrigues, Pedro E. Cruz, Paula M. Alves, Ana S. Coroadinha, and Manuel J. T. Carrondo, Downstream Processing of Lentiviral Vectors: Releasing Bottlenecks. HUMAN GENE THERAPY METHODS 23:255–263.